CRISPR发展之英雄榜



编译来源:Lander, E.S. (2016). The Heroes of CRISPR. Cell 164, 18-28.

2013年一篇指出 CRISPR (clustered regularly interspaced palindromic repeats) 技术可以準确且有效率地编辑活体真核细胞基因体的研究报告,在科学界颳起一阵风暴,从生物医学到农业,有成千个实验室应用此技术。本文将探讨从二十年前起发现微生物的基因体含有奇怪的重複序列,经确认为此一适应性免疫系统,到了解其生物特性,进而运用在基因工程上的发展过程,以及这科学研究历程给我们的启示。

CRISPR 规则性间隔重複迴文序列群的发现,起源于西班牙一地中海海港,Francisco Mojica 的指导教授发现生活在沼泽中一耐盐性极高的古细菌,其基因体会因为生长环境盐度不一样,而被限制酶切出不同片段。Mojica分析这些不同的基因片段,发现一个特殊结构含有类似迴文的重複序列及间隔,和其他已知的微生物重複序列不同。之后十年的时间,他致力于解开这结构的神密之处,发现其他的古细菌也具有相似的重複序列,而一日本研究团队在细菌裏也发现类似的结构。Mojica认为如此相去甚远的微生物却有相似的结构,在原㧡生物中一定有其特殊意义。由于Mojica才刚开始教职工作,研究经费不足,只好转而以生物资讯学来分析这奇特的重複序列,并命名为 SESRs (short regularly spaced repeats),之后修改成 CRISPR (clustered regularly interspaced palindromic repeats)。

20世纪结束时,Mojica已在二十种微生物基因体内找到 CRISPR序列。其他研究团队在不同微生物也有相同的发现,并且找到CRISPR 相关基因(CRISPR associated genes, cas),但是其生物功能仍是未知,于是众多假说被提出。后来Mojica 在分析重複序列之间的间隔序列(spacer) 有了重大发现: 一特定种大肠桿菌的 CRISPR 的间隔序列,居然和感染许多不同种大肠桿菌的P1 噬菌体的基因序列吻合,可是此一特定种的大肠桿菌本身并不会被P1 噬菌体感染,也就是説拥有此间隔序列,可以保护细菌本身不会再被同一噬菌体感染。他又继续分析了4,500 段间隔序列,其中88段和已知序列吻合,其中三分之二是来自病毒或接合质体。可是当他要发表此重大的发现时却连续被各大期刊拒绝,经过十八个月的努力,终于在2005年发表于 Journal of Molecular Evolution。

同时CRISPR系统的研究在世界各地陆续有不同的进展。法国国防部的科学家 Gilles Vergnaud 分析造成越南1964-1966年鼠疫的61株样品,发现其重複序列都相同,只有其同事Christine Pourcel发现在CRISPR 的前端间隔序列 (spacers)有所不同,因此提出CRISPR可能是将过去受感染的记忆保存下来,保护细菌不再受感染,但是他们的论文同样面对被期刊拒绝的状况,最后晚 Mojica一个月的时间发表于 Microbiology。服务于法国一食品公司的研究者Philippe Horvath和其同事Rodolphe Barrangou在2007年以实验证明 CRISPR 是一适应性防御免疫机制,同时他们也发现 Cas7参与形成新的间隔和重複序列,以及 Cas9 具有两种核苷酸酶部位HNH和 RuvC可以切断核苷酸,且为达到完全的免疫功效,间隔序列和标的序列必须完全相同。

2008年德国科学家John van der Oost 和其同事首先直接设计出以CRISPR为基础的免疫机制,像是帮细菌打了疫苗,不再受噬菌体感染。美国科学家 Luciano Marraffini和Erik Sontheimer 则证实 CRISPR 是以 DNA 为标的,并首先提出CRISPR 可能可以应用于不同物种的基因编辑,虽然有提出专利申请,但由于缺乏实验佐证,后来终究放弃。

Sylvain Monieau 延续 Barrangou 先前对 Cas9的研究,发现 Cas9会準确地切在PAM(proto-spacer adjacent motif) 前三硷基对的位置。另外 Emmanuelle Charpentier 和 Jὂrg Vogel团队则发现在细胞内第三多的转录物 tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)会和由CRISPR序列所转录出来的crRNA前身结合,再由 RNaseIII修剪为具功能性的产物,研究至此阶段已经能掌握CRISPR系统所需的要件。接下来是 Virginijus Siksnys成功地将 CRISPR 系统移至不同的生物体,达到一重要里程碑,确认 CRISPR-Cas9 系统所需且足够的元件:Cas9 核苷酸䩈、crRNA以及tracrRNA。他们以纯化的 Cas9蛋白研究整个过程的细节,最戏剧化的发现是利用设计CRISPR裏不同的间隔序列(spacer),让此系统去辨识特定的基因位置并切断 DNA,Siksnys 在2012年以此申请美国专利。大约在同时 Charpentier 和 Jennifer Doudna 合作也有同样的发现和进展,他们更进一步将crRNA和tracrRNA 连结成sgRNA (single-guide RNA),此一概念后来被广泛使用,经修改可以更有效地在生物体内作用。两个团队也同时都提出此一系统未来在生物科技上的应用潜力。

CRISPR发展之英雄榜

图一 发展基因体编辑技术的基础中三种已知系统中最简单的系统,Class2, Type II CRISPR-Cas系统。 A. 系统包含了CRISPR序列、四个蛋白基因(cas9,cas1,cas2和cns2)以及tracRNA。其中 CRISPR序列包括重複区域(黑色钻形)与外来入侵的基因片段所形成的间隔序列(spacer,彩色矩形)。一旦入侵的DNA和间隔序列吻合,cas9所转译出核苷酸酶,会将其切断,达到免疫的功效。而另外三个蛋白则是从入侵的DNA片段做出新的间隔序列,使自身不会再受相同的感染。 B. Pre-crRNA和 tracrRNA被转录出来 C. Pre-crRNA和 tracrRNA以其互补序列结合在一起,再由Cas9蛋白及 RNaseIII将其修短。 D. 所形成结构(Cas9+tracrRNA+crRNA)开始寻找和间隔序列相吻合的序列,找到后Cas9会抓住具有分子把手功能的 PAM,然后结合至目标区。 E. 于PAM上游三硷基对处切断目标DNA

下一个重大的发展来自华裔科学家张锋 (Feng  Zhang),他进一步修改 Cas9,找到适合存在人类细胞内的 tracrRNA,成功地将CRISPR系统应用到哺乳动物细胞,可以高效率且準确地修改特定基因,张锋更进一步以此系统做出複杂的老鼠系统来研究遗传疾病及癌症,并且从全基因库筛检,研究特定生物过程的必需基因,同时他和生物资讯学者Kooin 发现新的 Class 2 CRISPR系统,只需另一核苷酸酶及 crRNA两个元素便足够。张锋在2013年初于 Science 发表论文,成为此一领域被引用最多的文章。另一科学家 George Church也和张锋有相同的发现,即以全长的crRNA-tracRNA连结在一起,在哺乳动物细胞内的功能比较好,他同时编辑七处基因,分析不同的基因重组机制,并在同一期期刊发表编辑人类基因体的论文。至此众多科学家们陆续成功地以CRISPR为基础去编辑许多不同生物的基因体,更朝人类基因疗法及农业生产发展,甚至提出以此技术去设计人类胎儿的可行性。

CRISPR发展之英雄榜

图二 二十年来CRISPR系统的发展横跨九个国家十二个城市 1. 1993年 发现 CRISPR 2. 2003年 CRISPR 是一适应性免疫系统 3. 2006年 实验证实CRISPR确实具适应性免疫功能 4. 2008年 程式设计CRISPR 5. 2008年 CRISPR 作用在DNA 6. 2010年 Cas9 蛋白在crRNA的引导下切断双股 DNA 7. 2010年 发现tracrRNA 8. 2011年 在相隔甚远的生物体内重建 CRISPR系统 9. 2012年 在生物体外研究 CRISPR 10. 2012年 在哺乳类动物细胞内进行基因体编辑

二十年来整个CRISPR系统的发展过程,诉説着许多不同的层面的故事,包含了科学的研究发现、发表论文所面对的困难、研究经费问题和此技术可能引发的科学伦理问题,以及社会大众的认知。最初开研究动机只是想要了解耐盐性微生物所含的奇怪重複序列、军事上要抵抗生化武器或是食品工业上要增加优格的生产,并不是以编辑人类基因体或治疗疾病为目的。而目前新兴的科学研究方法,是在没有假设前提下,去分析大数据及基因库的资料。更特别的是,在CRISPR系统发展史上几个关键发现的科学家都非常年轻,他们不惧风险愿意挑战,拥有强烈的研究动机与信心,却常受限于没有足够的研究经费,这点暴露出科学研究经费资源分配问题,值得国家重新考量严肃面对。


参考文献



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